АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГЛИКОГЕНА В ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦИТОХИМИЧЕСКОГО И FRET МЕТОДОВ
Н. Н. Безбородкина, Г. И. Штейн, Е. В. Сивова, Л. Ю.
Честнова, Б. Н. Кудрявцев
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург;
электронный адрес: bezbor74@mail.ru
С помощью цитохимического и FRET (Forster Resonance Energy Transfer) методов исследовали структуру гликогена в гепатоцитах крыс при голодании и через
разные интервалы времени после введения животным глюкозы per os. Гепатоциты на предметных стеклах окрашивали с помощью флуоресцентного варианта
PAS-реакции. Окраска препаратов в течение 40 мин бромистым этидием-SО2 (EtBr-SO2) выявляла легкодоступную (ЛД) фракцию, а их
последующая окраска аурамином-SО2 (Au-SO2) в течение 50 мин - труднодоступную (ТД) фракцию гликогена в клетках. Общее содержание
гликогена (ЛД и ТД) в гепатоцитах на разных этапах рефидинга крыс определяли с помощью цитофлуориметра, а затем в тех же клетках измеряли эффективность
FRET. Регистрацию FRET в нескольких участках клеток производили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5, используя
процедуру FRET AB (Acceptor Photobleaching). Донором (D) в данной процедуре служил аурамин, а акцептором (А) - бромистый этидий. Показано, что эффективность
FRET в ходе рефидинга крыс глюкозой изменяется от 10 до 14 %, при этом структура гликогена оказывает заметное влияние на величину этого показателя.
Показано, что в клетках голодных крыс и на ранних сроках после введения животным глюкозы эффективность FRET коррелирует с величиной отношения A/D,
которая отражает степень заполнения внешних ярусов молекул гликогена остатками глюкозы. На более поздних сроках рефидинга подобная корреляция либо менее
выражена, либо отсутствует. Установлено, что при одном и том же значении A/D эффективность FRET может изменяться в 3-4 раза. Поскольку вероятность
передачи энергии от D к А пропорциональна 1/R6, где R - расстояние между D и А, такие колебания эффективности FRET означают, что молекулы
гликогена обладают лабильной структурой, в которой цепи гликозидных остатков могут отклоняться от своей оси на расстояние около половины их диаметра.
Ключевые слова: структура гликогена, фракции гликогена, гепатоциты, бромистый этидий-SО2, аурамин-SО2,
PAS-реакция, метод FRET
| Back
| Contents
| Main |
