ИССЛЕДОВАНИЕ ФОКУСОВ РЕПЛИКАЦИИ ПРИ ВЫСОКОМ РАЗРЕШЕНИИ МЕТОДОМ ШИРОКОПОЛЬНОЙ
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. I. АНАЛИЗ КОМПЛЕКСНОСТИ И СОДЕРЖАНИЯ ДНК В ФОКУСАХ
В. О. Чагин, 1 Ю. М. Розанов, Л. В. Соловьева, Н. В. Томилин
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург;
1 электронный адрес: chaga@link.cytspb.rssi.ru
Вновь реплицированные участки ДНК (РУД) образуют в ядрах клеток млекопитающих дискретные фокусы, которые
могут быть обнаружены с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Сопоставление числа таких репликативных фокусов (РФ)
с ожидаемым числом репликативных вилок (РВ) в ядрах клеток, фиксированных формальдегидом, указывает на то, что каждый РФ
содержит кластер из 10-20 пространственно сближенных РВ, что хорошо согласуется с известной гипотезой об осуществлении
репликации ДНК в клетках млекопитающих посредством синхронной активации кластеров репликонов. Однако неясно, обусловлено
ли указанное сближение синхронной активацией кластера репликонов, расположенных в каком-то участке генома (модель 1), или
является следствием функциональной концентрации репликативных белков в ядре, в область которой привлекаются для
репликации участки ДНК из структурно удаленных сегментов (модель 2). В настоящей работе с применением флуоресцентной
микроскопии на пределе оптического разрешения мы изучали распределение РУД в ядрах клеток человека, синхронизированных
обработкой оксимочевиной, обработанных гипотоническим раствором и фиксированных смесью метанол-уксусная кислота (МУК).
Наши данные показали, что в этих условиях РУД на препаратах ядер выявляются в виде многочисленных мини-фокусов репликации
(МФ) стандартного размера. Дальнейшие исследования показали, что такие МФ, особенно при коротких периодах мечения,
представляют собой различающиеся по яркости дифракционные пятна стандартного размера. Число и вариации яркости таких
пятен в основном зависят от эффективности гипотонического воздействия на конкретную клетку. Контроль за продвижением клеток
синхронного пика по S-фазе позволил оценить среднее содержание ДНК в одном МФ. В случае максимального эффекта
гипотонической обработки среднее содержание промеченной за 10 мин ДНК в МФ составляет порядка 40 т. п. н., а общее число
МФ приближается к числу репликонов, одномоментно активных в S-фазе. Распределение МФ в клетках ранней S-фазы в основном
случайное, однако в некоторых участках ядра можно наблюдать их организацию в симметричные структуры, цепочки или кластеры. Наоборот, в клетках поздней S-фазы МФ собраны в плохо разрешаемые кластеры. Увеличение числа МФ при увеличении эффекта гипотонического воздействия указывает на то, что РФ не являются стабильными структурами, как считали ранее, и говорит в пользу функционально-структурной кластеризации РВ в крупных репликативных фокусах фиксированных формальдегидом ядер (модель 2), которая нарушается при обработке ядер гипотоническим раствором и фиксации МУК.
Ключевые слова: репликация ДНК, репликативные фокусы, оксимочевина, проточная ДНК-цитометрия
Back
Contents
Main
